玻璃化冷冻技术对于做试管的姐妹来说并不陌生，今天我们就来聊聊最新的玻璃化冷冻技术。
一、玻璃化概念
液体的玻璃化(来自拉丁语vitrum)是一个复杂的物理过程,可以简单描述为液体在低温下的凝固,在没有冰晶形成的情况下获得极高的黏度。有时也被称为“无定形冰”或“玻璃水”。但在严格的意义上,由于没有晶体结构,它并不是“冰”。水或者稀盐溶液必须以极高的速度下降至水分子玻璃态转化的临界值温度时,才能到达玻璃化状态。玻璃化状态的形成同时与溶质浓度密切相关,两滴液体直接滴入液氮中,左侧液滴浓度较低,成分为磷酸盐缓冲液,该液滴形成冰晶;右侧液滴浓度较高,成分为磷酸盐缓冲液、乙二醇、二甲基亚砜和蔗糖,该液滴呈现为玻璃化状态。
液态玻璃态与晶态
二、玻璃化冷冻
玻璃化冷冻技术的基本原理是利用高浓度的冷冻保护剂溶液将细胞内水分子置换出来,经过急速降温,使细胞直接由液态转化为玻璃态。胚胎在整个玻璃化冷冻过程中细胞内、外均无冰晶形成。玻璃化冷冻的步骤:第一步是将胚胎放在平衡液中,使其渗透平衡;第二步是将胚胎放在更高浓度的玻璃化溶液中,使其进一步脱水;第三步是进行胚胎装载并迅速将其投入液氮中。玻璃化冷冻各个步骤的功能及原理如下:
(一)玻璃化冷冻的第一步:渗透平衡
玻璃化冷冻的第一步是将配子或胚胎放置在平衡液中,其成分为较低浓度的渗透性冷冻保护剂,可以在显微镜下观察到胚胎的皱缩和膨胀情况。当胚胎刚刚放进平衡液时,细胞外液渗透压较大,细胞内水分子迅速排出胞外,由于水分子较渗透性冷冻保护剂具有更快的移动速度,在冷冻的开始阶段胚胎形态发生皱缩;随着渗透性冷冻保护剂逐渐进入胞内,细胞渐渐扩张,直至恢复到原来的大小。此时,标志着水分子与冷冻保护剂在细胞内外达到渗透平衡。
玻璃化冷冻技术
平衡液通常联合使用2~3种渗透性冷冻保护剂,用来降低冷冻保护剂引起的细胞毒性。渗透性冷冻保护剂进入细胞后发挥的作用包括:提高细胞内黏度,降低细胞内水含量,减少冰晶形成。细胞内黏度增加,可以降低细胞内液体结晶的临界温度,并提高玻璃化转换的临界温度;当水分子与冷冻保护剂结合后,改变水分子的结晶成核过程,使得水分子不易参与冰晶的形成;进入细胞内的冷冻保护剂,可以代替原本与蛋白质等生物大分子结合的水分子,避免这些生物大分子构象改变。
(二)玻璃化冷冻的第二步:进一步脱水
玻璃化冷冻的第二步是将胚胎放置于玻璃化溶液中,其成分包括浓度更高的渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。具有更高浓度的玻璃化溶液促使细胞进一步脱水,细胞内黏度进一步加大。细胞内黏度的增大,有利于实现玻璃化状态。另外,加入的非渗透性冷冻保护剂可以紧紧包裹在细胞膜表面,保护细胞膜结构,维护细胞膜的稳定。随后,将胚胎装载到冷冻载体上。
不同类型的商品化玻璃化冷冻试剂盒,其冷冻保护剂的成分及浓度不尽相同,但玻璃化溶液中的非渗透性冷冻保护剂通常选用蔗糖。根据不同的冷冻保护剂浓度、种类、操作温度(室温或37℃),胚胎在平衡液中暴露时间为3~15分钟;胚胎在玻璃化溶液中的暴露时间及装载胚胎的时间合计为30~60秒。
(三)玻璃化冷冻的第三步:投入液氮
玻璃化冷冻的第三步,是将装有胚胎的冷冻载体迅速投入液氮中。此过程的降温速率可到达23 000℃/min。理想情况下,胚胎在整个玻璃化冷冻过程中细胞内、外均无冰晶形成,细胞内水分子来不及形成冰晶,而是直接转变成玻璃化状态,避免了冰晶形成引起的细胞损伤。
三、复苏
玻璃化冷冻的复苏原理与缓慢冷冻的复苏原理相似,包括细胞的复温及置换出细胞内部的渗透性冷冻保护剂。
